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本试剂盒用简便快速的方法即可在1小时内提取得到线粒体蛋白。本试剂盒含有的独特配方能够有效溶解线粒体膜组分。含有的蛋白酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高纯度的蛋白提供了保证。

本试剂盒提取的蛋白为具有天然蛋白构象的活性蛋白。本试剂盒中不含有EDTA，与金属螯合层析等下游应用兼容。本试剂盒提取的蛋白可用于WB、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、转录活性分析、Gel shift凝胶阻滞实验、酶活性测定等下游蛋白研究实验。

本试剂盒采用非酶法提取，提取过程简单方便，速度快，可在1小时内完成，而且绝少交叉污染，但是蛋白回收率相比酶法较低。酶法提取制备的线粒体总蛋白，回收率提高，蛋白纯度高，保持天然活性，但是耗时较长。如果需要更加快捷的提取试剂盒，可以选择非酶法的提取试剂盒，对提取速度没有要求的话，可以选择酶法提取试剂盒。请根据实际需要选择试剂盒。

本试剂盒提取的蛋白样本含有较高浓度的盐成分，不可直接用于2D电泳，如下游实验需要直接用于等电聚焦、双向电泳，请使用其他货号的试剂盒。也可以将最后样品除盐后再用于2D电泳。

• 蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2～8℃保存，开盖使用后-20℃保存。
  
• 蛋白酶抑制剂在2～8℃时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。

• 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。

• 提取液准备：
  每200μL预冷的蛋白提取液C中加入1μL蛋白酶抑制剂，混匀后置冰上备用。
  注：
  ● 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
  ● 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。
  ● 以下步骤中使用的蛋白提取液为此步配制好的含蛋白酶抑制剂的提取液。
  
• 取200～500mg新鲜植物样本叶片，用PBS洗净擦干后去除叶梗和粗脉。用手术剪刀尽可能剪碎。
  
• 加1mL提取液A后用匀浆机充分匀浆或者加适量提取液A后用匀浆机/Dounce匀浆器充分匀浆。
  注：培养细胞直接收集细胞后用Dounce匀浆器匀浆即可，匀浆后加提取液混匀后直接进行下步离心。
  
• 将匀浆液用100μm细胞筛过滤。
  注：
  ● 没有细胞筛的话，在4℃，稍微静置，让粗纤维，成团组织块等沉降，或者以低于100×g力条件下离心1分钟，收集细胞上清，弃组织沉淀。
  ● 有些含粘液较多的样品可能难以吸取，可以将1mL吸头尖稍微剪掉一点使用。
  ● 液体量较少细胞筛不好过滤时可以补加PBS缓冲液后过滤。
  
• 将滤液500×g离心5分钟，弃沉淀，取上清。
  
• 将上清在800×g条件下离心5分钟，弃沉淀，收集上清。
  
• 将上清在2000×g条件下离心5分钟，弃沉淀，收集上清。
  
• 将上清在12000×g条件下离心20分钟，弃上请，收集沉淀。
  
• 将沉淀用500μL试剂B重悬。
  
• 将悬液12000×g力离心20分钟，弃上清，收集沉淀。
  
• 在沉淀中加入100μL～300μL线粒体蛋白提取液C，充分混匀。
  
• 在4℃条件下振荡20～40分钟。
  注：
  ● 振荡时用振荡器/摇床的较低转速，保持液体稍微晃动即可。
  ● 无振荡条件也可不振荡，置4℃静置，稍微延长试剂C处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。
  
• 在4℃，14000×g条件下离心15分钟。
  
• 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到线粒体蛋白。
  
• 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
  注：
  ● 建议用BCA发进行蛋白定量。
  ● 蛋白样品-80℃存放一年没问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。

• 蛋白浓度低？
  处理部分组织样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂C的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
  
• 用什么方法定量蛋白？
  建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂A中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
  
• 提取的蛋白具有活性吗？
  本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。